Animal Data VS Human Data

L’obiettivo finale della ricerca biomedica è quello di capire le basi bio-molecolari e genetiche delle malattie umane al fine di sviluppare nuove e più efficaci modalità di diagnosi, prevenzione, od interventi terapeutici destinati al loro trattamento [1-2].

Poichè non è possibile effettuare indagini di ricerca fondamentale utilizzando esseri umani come “cavie”, gli scienziati hanno dovuto sviluppare modelli alternativi di malattie umane.

Animali come topi, ratti, cani, gatti, primati non-umani ed altri ancora, vengono regolarmente utilizzati nella ricerca biomedica e tossicologica [3], ciò comporta negli animali traumi e disordini creati da agenti chimici, mezzi chirurgici o manipolazioni genetiche, con lo scopo di mimare aspetti selezionati di malattie ed invalidità umane. Pertanto, gli animali utilizzati nelle procedure sperimentali vengono appunto definiti ”modelli”, modelli a cui una determinata condizione patologica viene artificialmente indotta con la conseguenza che potrebbero emergere significative differenze dalle caratteristiche originarie di una malattia spontaneamente insorta nel paziente.

Allo stato attuale, i modelli animali rappresentano i principali sistemi di test utilizzati nel tentativo di valutare tollerabilità e sicurezza delle sostanze chimiche, come richiesto dagli enti regolatori e come previsto dai protocolli delle linee guida internazionali (ad es. OECD), ed anche per le prove di efficacia nello sviluppo farmacologico [4].

Tuttavia, un crescente e determinante numero di evidenze scientifiche suggerisce in maniera irrefutabile che gli studi animali risultano troppo spesso inaffidabili ed inadeguati [1-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20-21-22-23-24-25-26-27]. Questo viene illustrato chiaramente anche dall’elevato tasso di fallimento rilevato nel processo di sviluppo farmacologico (drug development), dove il 95-97% dei candidati farmaci che si sono dimostrati promettenti in fase pre-clinica su animali non si traduce poi negli studi umani principalmente per inefficacia o significativa tossicità [28-29-30-31]. Le differenze tra specie su base fisiologica, neuroendocrina, anatomica, per citarne alcune, vengono oggi riconosciute come uno dei maggiori motivi alla base dell’inefficienza produttiva rilevata nello sviluppo di farmaci efficaci e sicuri destinati all’applicazione clinica per la specie umana [3-10-13-31-32-33-34-35-36]. Anche piccole differenze tra specie possono risultare fondamentali nell’impedire l’estrapolazione di dati utili da una specie all’altra [3].

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La riconosciuta inadeguatezza degli attuali modelli preclinici, sia in vitro (2D) che in vivo, ha contribuito a stimolare ed incentivare lo sviluppo di tecnologie cosiddette ‘’human based-human relevant’’ (incentrate cioè sulla biologia umana) che impiegano cellule e tessuti di origine umana e sistemi in vitro più adatti a riprodurre le condizioni fisiologiche e gli stimoli che si ritrovano nell’organismo vivente (es. tridimensionalità, flusso di nutrienti, connessione tra tessuti diversi), ovvero  biotecnologie capaci di bypassare i limiti dei tradizionali sistemi di ricerca non-clinica, in riferimento allo studio di condizioni patologiche ed allo sviluppo di nuovi principi attivi in ambito farmacologico [1-6-7-10-13-17-18-19-23-25-37-38-39-40-41-42-43].

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Quello che sarebbe interessante verificare è una stima del livello di accuratezza predittiva offerta da queste nuove, avveniristiche biotecnologie human-based e quanto queste potrebbero fornire risultati potenzialmente più rilevanti per la specie umana rispetto ai test su animali.

Un sommario ed indicativo confronto tra studi animali e metodi di ricerca avanzata human-based potrebbe aiutare ad elaborare un’analisi critica ed oggettivamente fondata sull’affidabilità dei diversi approcci di ricerca presi in esame per gli scopi prefissi.

Di seguito verranno indicati, in maniera molto succinta, con un rapido accenno, alcuni esempi in tal senso con riferimento a studi tossicologici e modellazione di malattie.

TOSSICOLOGIA

STUDIO MEIC

Il programma Multicenter Evaluation of In Vitro Cytotoxicity (MEIC) è stato uno studio collaborativo internazionale che mirava a valutare la rilevanza dei saggi tossicologici in vitro per la tossicità acuta umana. Alla fine del programma, nel 1996, 29 laboratori avevano testato i 50 prodotti chimici di riferimento in 61 saggi in vitro. Scopo dello studio pluriennale MEIC era quello di verificare se i test in vitro potrebbero essere utilizzati per la stima e la previsione della tossicità acuta negli esseri umani ed individuare anche la migliore batteria di test per tale scopo. Il risultato emerso da questa ricerca estensiva riuscì a dimostrare che i test in vitro che utilizzavano cellule umane erano più accurati nel predire la tossicità presa in esame rispetto ai corrispettivi, tradizionali studi animali (LD50) [44-45]. E’ opportuno tenere conto che si tratta di uno studio relativamente datato e che da allora le tecnologie in vitro hanno conseguito progressi enormi.

N.B.:

Il tradizionale test dell’ LD50 (Lethal Dose 50,  dose di una sostanza, somministrata in una volta sola, in grado di uccidere il 50%, cioè la metà, di una popolazione campione di cavie animali), così come concepito originariamente, è stato eliminato dalle linee guida internazionali che disciplinano la sperimentazione di prodotti chimici e farmacologici [46-47], al suo posto sono stati ideati nuovi protocolli, come la ”Up-and-Down Procedure” e la ”Fixed Dose Procedure”, volti a ridurre il numero degli animali utilizzati e ”migliorare”, sotto determinati aspetti, il test tossicologico in questione. Tuttavia, così come per la ”prima versione” dell’LD50 [47], la rilevanza scientifica dei predetti studi animali in funzione dell’esperienza tossicologica umana resta fortemente dubbia [46].

TOX21

Il programma del governo Statunitense ”Tox21”, che utilizza la robotica su larga scala nello screening della tossicità in vitro delle sostanze chimiche, ha testato 10.000 sostanze chimiche e ha concluso che i dati dei test in vitro risultano essere più affidabili e precisi rispetto agli studi animali nel predire la tossicità umana.

E’ quanto emerge da un paper recentemente pubblicato sulla rivista Nature Communications [38] da Scienziati-Ricercatori appartenenti come ruolo agli US NIH (National Institutes of Health, la più importante istituzione statunitense per quanto riguarda la Ricerca Biomedica, quella responsabile dell’erogazione dei fondi).

Gli autori hanno riferito che le prove di tossicità eseguite utilizzando ”modelli animali” sono costose e spesso forniscono dati difficili da estrapolare per la situazione umana di riferimento a causa delle differenze inter-specie.

Dopo aver confrontato gli oltre 50 milioni di dati raccolti sui diversi tipi di test, i ricercatori hanno affermato che i modelli in vitro sono capaci di predire con grande precisione gli effetti tossici sia su animali che su esseri umani. Anche se i risultati dovranno essere ulteriormente analizzati, gli autori dello studio spiegano che i test tossicologici possono essere eseguiti con successo ed in maniera più affidabile ed accurata usando colture cellulari che utilizzano materiale biologico di origine umana rispetto ai tradizionali protocolli sperimentali condotti con animali.

MODELLI COMPUTAZIONALI

Per quanto concerne l’evoluzione dei sistemi in silico, importanti progressi sono stati conseguiti con quelli di ultima generazione ad esempio per quanto riguarda gli studi di biodisponibilità (una delle principali proprietà farmacocinetiche), orale in questo caso [41].

E’ ben noto che gli studi di farmacocinetica e biodisponibilità orale condotti su modelli animali forniscono una scarsa predittività in funzione umana [41-48-49-50].

(lo schema sotto raffigura una comparazione tra specie in riferimento alla biodisponibilità orale per diversi composti presi in esame, nessuna correlazione) [16]

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Le previsioni di biodisponibilità orale dell’expert system Impact-F, ideato dalla compagnia Biotech ”PharmaInformatic”, si sono dimostrate più accurate rispetto agli studi animali [41].

STUDI IN VITRO PER TESTARE IL POTENZIALE TOSSICOLOGICO DEI PRODOTTI DEL TABACCO

Una recente review ha analizzato i saggi in vitro human-based attualmente disponibili per rilevare la tossicità dei prodotti del tabacco [51]. Anche in questo caso, i metodi in vitro, si sono rilevati più convenienti ed affidabili rispetto ai risultati ottenuti con gli studi animali.

Dichiarano gli autori:

”Gli studi animali non riescono ad offrire vantaggi scientifici o pratici (se paragonati ai metodi alternativi analizzati nello studio, ndr).”

STUDI DI TERATOGENESI

La teratogenesi indica lo sviluppo anormale di alcune regioni del feto durante la gravidanza, che si traduce nella nascita di un bambino che presenta gravi difetti congeniti. Esempio classico di questo effetto avverso sullo sviluppo del feto è la tragica vicenda della talidomide, farmaco prescritto in diversi paesi alle donne in gravidanza negli anni ’50 del secolo scorso e ritirato poco dopo, nei primissimi anni ’60, dopo aver causato la nascita di circa 10 mila bambini gravemente deformati [52].

Anche per quanto concerne la tossicologia riproduttiva e dello sviluppo i modelli animali si sono rivelati inaffidabili nel fornire un’adeguata accuratezza predittiva delle risposte umane [53-54-55-56-57-58-59-60].

Proprio per queste ragioni, recentemente sono stati sviluppati metodi alternativi agli studi su animali, che ricorrono all’utilizzo di cellule staminali umane pluripotenti indotte (HiPSC, Human Induced Pluripotent Stem Cells), capaci di ovviare ai problemi per l’estrapolazione di risultati utili riconducibili alle significative differenze inter-specie [61]. Questi nuovi approcci si sono dimostrati più sensibili e più specifici nel rilevare la teratogenicità umana sia rispetto ai modelli animali che al mEST (saggio in vitro che utilizza cellule staminali embrionali di topo). I risultati rilevati insomma sembrano piuttosto promettenti.

 

MODELLAZIONE DI MALATTIE

I modelli animali spesso non sono in grado di riprodurre accuratamente la malattia umana, questo dato viene riconosciuto come uno dei principali fattori alla base della scarsa traduzione di risultati utili nel progresso clinico-farmacologico [31-62-63-64-65]. Pertanto, nuove strategie di ricerca, caratterizzate da approcci human-based, volte a ricreare un quadro più accurato della condizione umana sotto studio sono già state ideate e continuano ad essere oggetto di ulteriori sviluppi. Vediamo insieme qualche rapido accenno, giusto a titolo di mero esempio tra altri rappresentabili.

ALZHEIMER

Circa 300 candidati farmaci, dimostrati sicuri ed efficaci su animali, non si sono tradotti nella pratica clinica su esseri umani [66-67-68-69]. Il 99.6% dei farmaci testati con successo su animali tra il 2002 ed il il 2012 ha fallito la traduzione su esseri umani [68-69-70-71]. Come per altre aree di studio, anche per quanto riguarda l’Alzheimer i limiti dei modelli animali nel ricapitolare fedelmente la patologia umana vengono riconosciuti come una delle cause principali del fallimento traslazionale dei risultati dalla fase preclinica a quella clinica e quindi della mancanza di cure efficaci per i pazienti [6-39-72-73-74]. Infatti, i modelli murini geneticamente modificati, gli animali più comunemente utilizzati negli studi sull’Alzheimer, sono in grado di ricapitolare solo alcuni aspetti della malattia umana in modo abbastanza grezzo e potenzialmente fuorviante [75].

Recentemente è stato creato un avanzato modello di AD (dall’acronimo inglese ”Alzheimer Disease”, malattia di Alzheimer) in vitro (3D), grazie anche all’utilizzo di cellule staminali neurali di origine umana, in cui sono state configurate tutte quelle caratteristiche patologiche salienti dell’AD umana [75], quello che non si è mai riusciti a riprodurre nei modelli animali. I ricercatori sono così ottimisti riguardo alle potenzialità di questo nuovo sofisticato approccio in vitro  che ritengono vi siano fondati motivi per spostare il focus da modelli inadeguati ed obsoleti come quelli animali a modelli più rilevanti per il paziente affetto dalla patologia [76].

SLA

Thomsen et al. riferiscono che dopo mezzo secolo di prove ed oltre 150 differenti agenti terapeutici o strategie testate nei modelli preclinici animali di SLA, solo il Riluzolo è sembrato essere l’unico farmaco sviluppato capace di prolungare la sopravvivenza del paziente,  anche se solo di circa 2-3 mesi,  ovvero alquanto miseramente [77].

Affermano i ricercatori:

”Gli studi clinici (su esseri umani, ndr) basati sui modelli murini (roditori, ndr) di SLA hanno ampiamente fallito, il che indica la necessità dell’esplorazione di nuovi modelli di SLA.” [78]

Dopo aver riferito dei limiti dei modelli animali utilizzati nell’area di ricerca sulla SLA (Sclerosi Laterale Amiotrofica), Clerc et al. hanno indicato nuovi metodi di studio human-based potenzialmente capaci di offrire risultati migliori rispetto a quelli marginali ottenuti fino ad oggi con i modelli animali. Tali approcci, più rilevanti per la specie umana ed in grado di bypassare il problema delle summenzionate differenze tra specie, includono anche: studi genetici in campioni di popolazione umana, modelli cellulari e tissutali, modelli in vitro di ultima generazione che utilizzano HiPSC ed altri ancora [79].

 

MALATTIE INFIAMMATORIE INTESTINALI

Importanti passi avanti per quanto concerne lo studio delle malattie infiammatorie intestinali, come il Morbo di Crohn, sono stati conseguiti grazie alla microfluidica integrata (sistemi microfisiologici ”organs on chips”). Gruppi di ricerca come quelli del rinomato Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University (U.S.A.), hanno realizzato modelli di ”intestino umano su chip” che permettono analisi dettagliate sui meccanismi patologici di interesse altrimenti impossibili da studiare con i tradizionali saggi in vitro 2D ed anche con i modelli animali di malattia.

In questo campo della ricerca, e’ estremamente rilevante lo sviluppo degli studi nell’ambito del Microbioma Umano , dove sono stati identificati nuovi ceppi batterici e virali quali cause dirette e/o indirette di molte patologie umane, anche nel campo delle neuroscienze.  Lo studio sul Microbioma Umano sta evidenziando in campo scientifico internazionale l’importanza e la validita’ scientifica della ricerca human-based.

Kim et al. (2015) hanno riferito sull’evoluzione dei loro studi con il predetto modello di malattia umana su biochip [80]:

”Tutte queste scoperte sono state possibili grazie alla nostra capacità di integrare e modulare in maniera indipendente i diversi parametri del sistema nell’intestino su chip (ad esempio simulazione della peristalsi, presenza di cellule immunitarie e microbi), e sarebbe estremamente difficile, se non impossibile, rilevare queste relazioni dirette su modelli animali o anche negli studi clinici umani. Presi insieme, questi risultati dimostrano che l’intestino umano su chip offre una piattaforma modulare robusta non solo per l’analisi delle interazioni intestino-microbioma e per le interrogazioni del caso su eziologia e sviluppo delle malattie infiammatorie intestinali umane, ma anche per definire potenziali bersagli terapeutici e testare candidati farmaci.”

Quanto sopra illustrato suggerisce che incentrare la ricerca direttamente sulla biologia e sulla genetica umana può tradursi in un significativo avanzamento del progresso biomedico.

La storia, anche in questo caso, insegna molto. Si pensi ad esempio a quanto ottenuto fino ad oggi nell’area di ricerca sull’HIV/AIDS:

circa 100 trattamenti farmaco-terapeutici hanno funzionato su modelli animali, eppure nessuno di questi si è tradotto nella pratica medica umana [81-82] (infatti i ceppi di retrovirus dell’HIV studiati sono diversi tra le specie animali e quella umana)

La stragrande maggioranza dei più importanti progressi conseguiti in quest’area di studio sono da attribuirsi ad osservazioni cliniche fatte direttamente sugli esseri umani ed approcci di ricerca human-based.

E’ stata la ricerca clinica sugli esseri umani ad isolare il virus dell’HIV, a descrivere il decorso naturale della malattia ed identificare i fattori di rischio, e non la ”s.a.”. Con la ricerca in silico e quella in vitro, utilizzando globuli bianchi umani, sono state definite sia l’efficacia sia la tossicità di quasi tutti gli attuali farmaci anti-AIDS, inclusi l’AZT, il 3TC ed enzimi inibitori (protease inhibitors), che hanno inciso significativamente sull’aspettativa di vita del paziente affetto da AIDS. Nella letteratura scientifica questo viene dichiarato e dimostrato in maniera del tutto irrefutabile [83-84-85].

Barh et al. (2011) hanno riferito che:

”In conclusione, gli spunti critici sull’AIDS, sul suo meccanismo, e la sua terapia sono derivati esclusivamente da studi in vitro ed in vivo su esseri umani, mentre gli studi animali hanno sostanzialmente fallito nel riprodurre l’AIDS umano.” [84]

Allo stesso modo, Haigwood et al. (2008) hanno affermato:

”È importante sottolineare che, le prime ricerche nei laboratori accademici e nell’industria hanno portato allo sviluppo dei farmaci anti-HIV o antiretrovirali (ARV) in assenza di modelli animali […] quasi tutti i farmaci antiretrovirali attualmente in uso sono stati approvati senza test di efficacia eseguiti su modelli animali.” [85]

Come già dichiarato da altri: ”il miglior modello per gli esseri umani è umano” [86], questo significa che una ricerca realmente affidabile e credibile deve necessariamente essere incentrata sulla biologia della specie di destinazione utilizzando tecnologie moderne, più attendibili, rilevanti, non invasive, e con potenzialità considerevoli.

 

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Doverosa precisazione:

con ciò non si vuole affermare che le nuove metodologie in vitro, in silico ed integrate non abbiano anch’esse dei limiti (tutti i modelli li hanno). Certo, tanto è stato fatto, molto altro deve essere però ancora realizzato. Si può senz’altro avanzare di più nei progressi tecnologici e soprattutto, considerate le inequivocabili evidenze sopra indicate, sarebbe saggio e razionale smettere di promuovere e spingere i superati modelli animali in un contesto dove c’è già troppo affidamento sugli stessi. Visto che proprio tale eccessivo affidamento è ritenuto uno degli ostacoli principali alla traslazione dei risultati dal laboratorio al paziente e quindi all’ avanzamento della medicina.

Autori:

Alfredo Lio

Prof.ssa Mirta Bajamonte, Ph.D. (Biomedico-Biotecnologo, Ricercatrice, Docente di Embriologia Clinica presso l’Università degli studi di Palermo, Docente presso LUdeS Foundation H.E.I., Malta)

Dr.ssa Manuela Cassotta (Biologa e Biotecnologa)

Per l’associazione medico-scientifica O.S.A. (Oltre la Sperimentazione Animale)

16 aprile 2017

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