Terreni di coltura cellulare: il caso del siero fetale bovino.

Nella ricerca biomedica e tossicologica, i metodi in vitro, cioè quegli approcci di prova sperimentale che si avvalgono dell’utilizzo di materiale biologico come cellule e tessuti, si possono utilizzare per studiare le attività metaboliche delle cellule. In particolare, all’interno della ricerca biomedica e tossicologica, nell’ottica del principio delle 3R (Refinement, Reduction, Replacement), essi potrebbero dimostrarsi validi strumenti per riuscire a ridurre od anche sostituire gli esperimenti condotti su animali, sia come ”stand-alone”, sia come parte di una ”strategia integrata di valutazione e sperimentazione” insieme ad altri metodi non basati sull’animale come quelli in silico. Le cellule sono mantenute in condizioni definite e consolidate nel tempo, che in genere coinvolgono l’incubazione a 37° C, con una miscela di gas umidificata al 5% di CO2. Un terreno di base spesso utilizzato è il Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM). A seconda del tipo di cellula questo mezzo è completato con elementi essenziali per la proliferazione, la migrazione e la differenziazione delle cellule. Solitamente, il siero usato come integratore è quello bovino fetale, ovvero l’FBS (Fetal Bovine Serum) o l’FCS (Fetal Calf Serum) [1].

I sieri più utilizzati sono quelli ottenuti da animali neonati oppure dai feti bovini.

Il siero animale è una miscela estremamente complessa di un gran numero di costituenti, biomolecole a basso ed alto peso molecolare, con diverse attività, fisiologicamente bilanciati, che favoriscono crescita ed inibitori enzimatici.

La moderna biologia cellulare e la biochimica hanno permesso l’identificazione dei fattori di crescita del siero coinvolti nei processi in vivo, come la proliferazione cellulare e la riparazione dei tessuti, la maturazione e differenziazione cellulare, oppure la maturazione embrionale, il lignaggio delle cellule staminali, la differenziazione epiteliale, etc. [2].

 

Le principali funzioni del siero sono di fornire:

 

  1. fattori ormonali per stimolare la crescita e la proliferazione cellulare e la promozione di funzioni differenziate

 

  1. proteine ​​di trasporto che trasportano ormoni (ad es. transcortina), minerali ed oligoelementi (ad es. transferrina) e lipidi (ad es. lipoproteine​​)

 

  1. fattori di attaccamento e diffusione, in qualità di punti di germinazione per fattori di adesione cellulare

 

  1. stabilizzanti e disintossicanti necessari per mantenere il pH o inibire le proteasi sia direttamente, come ad esempio con l’aggiunta di α-antitripsina o α2-macroglobulina, o indirettamente, agendo come un diluitore non specifico per le proteasi ed altre molecole (tossiche) [3].

 

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Tuttavia, l’utilizzo di siero animale come supplemento di  terreno di coltura cellulare comporta diversi e rilevanti problemi sia di tipo scientifico che etico [4-5-6-7-8-9-10].

 

Preoccupazioni etiche

La quantità di FBS prodotta per il mercato mondiale è stimata aggirarsi all’incirca sugli 800.000 litri l’anno, che equivale ad impiegare circa 2 milioni di feti bovini sottoposti al prelievo del loro siero, e le proiezioni prevedono aumenti nella produzione [4].

Serie e profonde preoccupazioni etiche sono state sollevate per quanto riguarda il benessere dei feti utilizzati nella raccolta, produzione e lavorazione dell’FBS [4-5-6-7-8-9-10].

In breve, i feti bovini da cui il sangue viene prelevato per la produzione dell’FBS sono ottenuti da vacche gravide inviate al macello. Nelle enormi mandrie di bovini ”da carne”, tori e mucche vagano liberamente insieme, e di conseguenza molte mucche vengono trovate gravide al momento della macellazione. L’8% circa delle vacche che giungono al macello risultano gravide in diverse fasi della gestazione [4]. Quando all’atto della macellazione una mucca viene scoperta incinta, il feto viene separato ed il sangue fetale, a questo punto, dovrebbe essere raccolto in condizioni asettiche. Tuttavia, nonostante le norme vigenti sul benessere degli animali, la situazione specifica presso i siti di produzione locale non può garantire sempre le migliori prassi nel trattamento dei feti durante la raccolta del sangue e le condizioni del sangue stesso.

Questo prelievo viene di solito eseguito utilizzando grossi aghi infilati direttamente nel cuore pulsante del feto senza ricorrere ad anestesia, definito scientificamente ”pungolamento cardiaco” [3].

In alternativa, il sangue fetale può essere raccolto mediante puntura della vena ombelicale o puntura della vena giugulare [11]. Pertanto, la raccolta del sangue comporta una significativa manipolazione del feto, e questo è fonte di potenziale sofferenza.

 

Preoccupazioni scientifiche

Dal punto di vista biologico cellulare, gli svantaggi della supplementazione dei terreni di coltura con l’FBS sono molteplici:

  1. il siero è un integratore mal definito e quindi rappresenta un fattore imprevedibile nella coltura cellulare e poco ripetibile (ogni batch di siero è diverso, come è diverso ogni animale da cui proviene il siero) [12-13].

 

  1. i lotti di siero mostrano variazioni quantitative e qualitative nella loro composizione e quindi introducono significativa variabilità rendendo gli esperimenti (e quindi i risultati) difficilmente, o per nulla, riproducibili [4-5-6-13]. In effetti, la non riproducibilità di molti risultati ottenuti con colture cellulari, oltre che con modelli animali, viene riconosciuta come fonte di grave preoccupazione all’interno della comunità scientifica e non solo [14], anche in funzione del depauperamento delle ingenti risorse investite ogni anno nella ricerca biomedica. Quindi, non solo tutto questo si traduce in un seria problematica dal punto di vista scientifico, ma quando un saggio in vitro che coinvolge l’FBS come integratore di coltura dovrebbe essere applicato in un contesto normativo-regolatorio, in realtà lo stesso risulta quasi del tutto inutile [5].

 

  1. il siero può contenere diverse quantità di endotossine, emoglobina, ed altri fattori variabili e negativi per la corretta riuscita di un esperimento, perchè derivanti dalle condizioni soggettive dell’animale al momento del prelievo, dall’ambiente, dalla salute e dallo stress di ogni singolo animale.

 

  1. il siero può essere anche una potenziale fonte di contaminanti quali, ad esempio, micoplasmi, virus o prioni [4-6]

 

Quindi, in definitiva, il siero presenta diverse variabili sconosciute nel sistema di coltura, rendendo gli esperimenti poco attendibili perché non riproducibili esattamente con le stesse condizioni.

Inoltre, i terreni di coltura siero-integrati possono essere incapaci di sostenere la crescita di specifici tipi di cellule, e nelle colture primarie di cellule epiteliali altamente differenziate il siero animale può essere incapace di prevenire la crescita eccessiva della coltura da fibroblasti [15]. Nondimeno, per ovviare a questo genere di inconvenienti relativi all’uso dell’FBS, sono stati sviluppati terreni di coltura cellulare di derivazione NON-animale capaci di ridurre fortemente o anche sostituire completamente il siero fetale bovino [16-17], come ad esempio il lisato piastrinico umano [18-19], oppure, i sieri artificiali, che ora molte compagnie stanno sviluppando per ovviare alle differenze tra batch ed alla contaminazione.

 

I benefici (scientifici ed etici) della sostituzione del siero animale sono certamente rilevanti.

 

Aspetti scientifici:

– Condizioni di coltura in vitro chimicamente definite e controllate

– Ridotta variabilità nella composizione dei terreni di coltura

– Riduzione dei rischi di contaminazione (micoplasmi, virus, prioni, etc.)

– Vantaggi nell’isolamento dei prodotti di coltura cellulare (down-stream processing)

– Standardizzazione dei protocolli a causa della natura quantificabile e riproducibile dei terreni di coltura non animali, indipendenti dai problemi di batch riscontrati con l’uso di siero animale

 

Importanti contributi, censiti in letteratura, testimoniano quanto sopra rappresentato [20-21].

 

Aspetti etici:

– Si evita del tutto la sofferenza degli animali

 

Alla luce di queste importanti innovazioni tecnologiche, diventa comprensibile, e sempre più insistente, la sollecitazione di molti scienziati, rivolta agli organi regolatori, onde sostituire il siero animale con metodi più moderni, affidabili e certamente più etici [4-22-23].

 

Alfredo Lio, Socio Volontario dell’Associazione Medico-Scientifica O.S.A.

Dr.ssa Susanna Penco, Biologa, Ph.D., Ricercatrice (D.I.M.E.S., Dipartimento Medicina Sperimentale, Università degli Studi di Genova), Socia dell’Associazione Medico-Scientifica O.S.A.

Dr.ssa Valentina Muto, Biologa, Ph.D., Ricercatrice (Istituto Superiore di Sanità, Roma)

 

26 maggio 2018

 

Bibliografia:

 

[1] van der Valk, J. et al. Improving in vitro methods by developing and using defined culture media. Altex 27, Suppl. 2/10:140-141, 2010. Link: http://www.altex.ch/resources/van_der_Valk.pdf

[2] Werner, S. & Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol Rev. 2003 Jul;83(3):835-70. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12843410

[3] Brunner, D. et al. Serum-free Cell Culture: The Serum-free Media Interactive Online Database. ALTEX. 2010;27(1):53-62. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20390239

[4] van der Valk, J. et al. Fetal Bovine Serum (FBS): Past – Present – Future. ALTEX. 2018;35(1):99-118. doi: 10.14573/altex.1705101. Epub 2017 Aug 9. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28800376

[5] van der Valk, J. & Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish? Altern Lab Anim. 2017 Dec;45(6):329-332. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29313704

[6] Even, M, S. et al. Serum-free hybridoma culture: ethical, scientific and safety considerations. Trends Biotechnol. 2006 Mar;24(3):105-8. Epub 2006 Jan 19. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16427150

[7] van der Valk, J. et al. The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. Toxicol In Vitro. 2004 Feb;18(1):1-12. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14630056

[8] van der Valk, J. et al. Optimization of chemically defined cell culture media – Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicol In Vitro. 2010 Jun;24(4):1053-63. doi: 10.1016/j.tiv.2010.03.016. Epub 2010 Mar 31. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20362047

[9] 3R, CCAC. Fetal Bovine Serum. Link: http://3rs.ccac.ca/en/testing-and-production/tp-production/fetal-bovine-serum.html

[10] Tekkatte, C. et al. “Humanized” stem cell culture techniques: the animal serum controversy. Stem Cells Int. 2011;2011:504723. doi: 10.4061/2011/504723. Epub 2011 Apr 3. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21603148

[11] Jochems, C, E. et al. The use of fetal bovine serum: ethical or scientific problem? Altern Lab Anim. 2002 Mar-Apr;30(2):219-27. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11971757

[12] Bjare, U. Serum-free cell culture. Pharmacol Ther. 1992;53(3):355-74. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1409851

[13] Gstraunthaler, G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX. 2003;20(4):275-81. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14671707

[14] Munafò, M. Metascience: Reproducibility blues. Nature. 2017 Mar 29;543(7647):619-620. doi: 10.1038/543619a. Link: https://www.nature.com/articles/543619a?WT.mc_id=TWT_NatureNews

[15] Taub, M. The use of defined media in cell and tissue culture. Toxicol In Vitro. 1990;4(3):213-25. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20837419

[16] Witzeneder, K. et al. Human-Derived Alternatives to Fetal Bovine Serum in Cell Culture. Transfus Med Hemother. 2013 Dec;40(6):417-23. doi: 10.1159/000356236. Epub 2013 Nov 29. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24474892

[17] Woehrling, E, K. et al. Brain-derived neurotrophic factor as an indicator of chemical neurotoxicity: an animal-free CNS cell culture model. Altern Lab Anim. 2013 Dec;41(6):503-11. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24512234

[18] Rauch, C. et al. Alternatives to the Use of Fetal Bovine Serum: Human Platelet Lysates as a Serum Substitute in Cell Culture Media. ALTEX. 2011;28(4):305-16. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22130485

[19] ZenBio. Human Serum & Animal-Free Growth Supplement. Link: http://www.zen-bio.com/products/serum/fetal-bovine-serum.php

[20] Mathur, A. et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 2015 Mar 9;5:8883. doi: 10.1038/srep08883. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25748532

[21] Mahler, G, J. et al. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Altern Lab Anim. 2016 Oct;44(5):469-478. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27805830

[22] Gstraunthaler, G. et al. A plea to reduce or replace fetal bovine serum in cell culture media. Cytotechnology. 2013 Oct;65(5):791-3. doi: 10.1007/s10616-013-9633-8. Epub 2013 Aug 22. Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23975256

[23] Gstraunthaler, G. et al. FBS production problems demand to call for serum-free media. ALTEX 30(4): 560-561, 2013. Link: http://www.altex.ch/resources/altex_2013_4_558_562_News.pdf

 

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